Sensory MIP SPR: szybka detekcja simwastatyny w 10 minut

Czy możliwa jest szybka i precyzyjna detekcja simwastatyny bez kosztownej chromatografii?

Simwastatyna, inhibitor reduktazy HMG-CoA stosowany w terapii hipercholesterolemii od 1988 roku, w maksymalnej dawce 80 mg/dobę redukuje stężenie cholesterolu LDL o około 47%. Poza działaniem hipolipemizującym, lek wykazuje właściwości stymulujące wzrost kości, wspierające angiogenezę oraz potencjał przeciwnowotworowy, co czyni go przedmiotem intensywnych badań.

Dotychczasowe metody oznaczania simwastatyny – chromatografia cieczowa wysokosprawna (HPLC), spektrometria mas (LC-MS/MS) czy spektrofluorymetria – charakteryzują się dobrą czułością (LOD od 0,2 ng/mL do 0,05 μg/mL), ale wymagają czasochłonnej preparatyki próbek, drogiej aparatury i wykwalifikowanego personelu. Istnieje zatem potrzeba opracowania prostszych, szybszych i ekonomicznych metod detekcji, szczególnie w kontekście kontroli jakości produktów farmaceutycznych oraz monitorowania terapeutycznego.

Technologia molekularnie odciskowanych polimerów (MIP) połączona z powierzchniowym rezonansem plazmonowym (SPR) stanowi obiecującą alternatywę. MIP tworzą specyficzne kawerny komplementarne do cząsteczki wzorcowej, zapewniając wysoką selektywność rozpoznawania molekularnego. Sensory SPR z kolei umożliwiają wykrywanie wiązania molekuł w czasie rzeczywistym bez konieczności znakowania, oferując wysoką czułość i możliwość wielokrotnego użycia.

Jak skonstruowano i przetestowano sensory MIP SPR?

Badacze z Uniwersytetu Hacettepe w Turcji opracowali sensory SPR pokryte polimeryczną błoną poli(HEMA-MATrp) z odciskami molekularnymi simwastatyny. Złote powierzchnie chipów SPR modyfikowano allylomerkaptanem, a następnie polimeryzowano mieszaninę zawierającą kompleks SIM:MATrp (stosunek molowy 1:120), monomer HEMA, sieciujący EGDMA oraz inicjator AIBN. Jako kontrolę przygotowano sensory NIP (polimer bez odcisku molekularnego) bez cząsteczki wzorcowej.

Charakterystykę powierzchni przeprowadzono metodami mikroskopii sił atomowych (AFM) i pomiaru kąta zwilżania. Głębokość błon polimerycznych wynosiła 86,11 nm dla MIP i 82,49 nm dla NIP. Kąt zwilżania dla MIP (81,3°) był wyższy niż dla NIP (69,8°), co potwierdzało obecność hydrofilowych kawiter simwastatyny w strukturze MIP.

Analizy kinetyczne przeprowadzono przy użyciu systemu SPR Imager II (GWC Technologies) w buforze fosforanowym pH 7,4, z przepływem 150 μL/min. Badano roztwory simwastatyny w zakresie stężeń 0,001–1,0 mg/mL. Każdy cykl pomiarowy (równowaga-adsorpcja-desorpcja) trwał około 10 minut, a desorpcję prowadzono roztworem 0,1 M NaCl.

Jakie parametry wiązania i selektywność wykazały sensory MIP?

Dane kinetyczne analizowano z użyciem trzech modeli izoterm adsorpcji: Langmuira, Freundlicha oraz Langmuira-Freundlicha. Model Langmuira wykazał najlepsze dopasowanie (R² = 0,999) w porównaniu do modelu Freundlicha (R² = 0,976) i Langmuira-Freundlicha (R² = 0,985). Parametry obliczone z modelu Langmuira: ΔR_max = 2,096 mg/mL, stała dysocjacji K_D = 0,189 mg/mL, stała asocjacji K_A = 5,263 (mg/mL)⁻¹.

„Właściwości wiązania simwastatyny na powierzchni sensora MIP SPR są homogeniczne i jednowarstwowe, z niskimi interakcjami lateralnymi” – piszą autorzy badania. Wysoka wartość K_A w stosunku do K_D wskazuje na silne powinowactwo simwastatyny do odcisków molekularnych w strukturze MIP.

Selektywność sensorów testowano z użyciem strukturalnie podobnych statyn: rosuwastatyny (RSV, masa cząsteczkowa 481,5 g/mol) i atorwastatyny (ATV, 558,6 g/mol). Dla stężenia 0,5 mg/mL wartość %ΔR wynosiła: SIM – 3,655%, ATV – 0,974%, RSV – 0,597%. Współczynniki selektywności k wyniosły odpowiednio 3,752 (ATV) i 6,122 (RSV), a względne współczynniki selektywności k’ – 3,580 i 5,978, potwierdzając wysoką specyficzność sensorów MIP względem simwastatyny.

Sensory NIP wykazywały minimalną zdolność rozróżniania między testowanymi molekułami (%ΔR dla SIM: 0,624%), co potwierdza kluczową rolę odcisków molekularnych w selektywnym rozpoznawaniu.

Jak długo można wykorzystywać te same sensory?

Możliwość wielokrotnego użycia sensorów MIP SPR oceniano w czterech kolejnych cyklach adsorpcja-desorpcja-regeneracja z użyciem roztworu SIM o stężeniu 0,5 mg/mL. Wydajność sensorów utrzymywała się na poziomie 98%, bez istotnego spadku zdolności wiązania. Desorpcję przeprowadzano roztworem 0,1 M NaCl przez 2 minuty, co skutecznie usuwało związane cząsteczki simwastatyny i regenerowało powierzchnię sensora.

Długoterminową stabilność badano przez 6 miesięcy, przeprowadzając analizy kinetyczne w pierwszym, drugim, czwartym i szóstym miesiącu. Obserwowano stopniowy spadek wydajności: po 6 miesiącach spadek wynosił 10,66%, a w ciągu jednego dnia między kolejnymi pomiarami – jedynie 2,45%. Te wyniki potwierdzają wysoką trwałość struktur polimerowych na powierzchni sensorów SPR oraz możliwość ich wielokrotnego zastosowania w praktyce laboratoryjnej.

Czy sensory działają w próbkach biologicznych?

Walidację metody przeprowadzono z użyciem sztucznego osocza wzbogaconego simwastatyną w stężeniach 0,25, 0,5 i 1,0 mg/mL. Odzysk wynosił odpowiednio 99,93%, 99,68% i 100,15%, potwierdzając dokładność metody w matrycy biologicznej. Limit wykrywania w sztucznym osoczu określono na 0,00029 mg/mL – wartość porównywalną z LOD w buforze fosforanowym.

Analizy kinetyczne w sztucznym osoczu przebiegały według tego samego protokołu co w buforze: 2 minuty równoważenia buforem PBS pH 7,4, 6 minut adsorpcji próbki, 2 minuty desorpcji roztworem 0,1 M NaCl. Całkowity czas analizy wynosił około 10 minut, co stanowi znaczącą przewagę nad metodami chromatograficznymi wymagającymi preparatyki próbek i dłuższego czasu rozdziału.

Wyniki te sugerują możliwość zastosowania sensorów MIP SPR w monitorowaniu terapeutycznym simwastatyny oraz w kontroli jakości produktów farmaceutycznych zawierających tę substancję czynną.

Co ta technologia zmienia w praktyce laboratoryjnej?

Opracowane sensory MIP SPR oferują kilka istotnych zalet w porównaniu z konwencjonalnymi metodami analitycznymi. Po pierwsze, czas pojedynczej analizy wynosi jedynie 10 minut, podczas gdy metody chromatograficzne wymagają od 15 do 30 minut samego rozdziału, nie licząc preparatyki próbek. Po drugie, sensory można używać wielokrotnie – udokumentowano co najmniej 4 cykle z zachowaniem 98% wydajności, a stabilność przez 6 miesięcy ze spadkiem aktywności jedynie o 10,66%.

Czułość metody (LOD 0,15 μg/mL) jest porównywalna z metodami spektroskopowymi i wystarczająca do większości zastosowań w kontroli jakości farmaceutycznej. Choć LC-MS/MS oferuje znacznie niższy LOD (0,2 ng/mL), metoda ta wymaga drogiego sprzętu i wykwalifikowanego personelu, co ogranicza jej dostępność w rutynowych laboratoriach.

Kluczowym ograniczeniem jest na razie brak walidacji w rzeczywistym osoczu pacjentów – badania przeprowadzono wyłącznie w sztucznej matrycy. Ponadto technologia SPR wymaga wstępnej inwestycji w sprzęt, choć długoterminowe koszty eksploatacji są niższe niż w przypadku metod chromatograficznych ze względu na możliwość wielokrotnego użycia sensorów i brak konieczności stosowania drogich odczynników.

Czy warto wdrażać sensory MIP SPR do rutynowej diagnostyki?

Badanie wykazało, że sensory SPR z molekularnie odciskowanymi polimerami stanowią obiecującą alternatywę dla konwencjonalnych metod oznaczania simwastatyny. Technologia łączy wysoką czułość (LOD 0,15 μg/mL), doskonałą selektywność (współczynniki k’ > 3,5), szybkość analizy (10 minut) oraz możliwość wielokrotnego użycia tego samego sensora. Model Langmuira potwierdził jednowarstwowy, homogeniczny charakter wiązania z wysokim powinowactwem (K_A = 5,263 (mg/mL)⁻¹).

Najważniejszą zaletą jest ekonomia czasu i zasobów – sensory zachowują 98% wydajności po czterech cyklach i mogą być przechowywane przez 6 miesięcy bez znaczącej utraty aktywności. Walidacja w sztucznym osoczu z odzyskiem 99,68-100,15% sugeruje potencjał zastosowania w próbkach biologicznych, choć konieczne są dalsze badania w rzeczywistym materiale klinicznym.

Technologia jest szczególnie atrakcyjna dla laboratoriów kontroli jakości farmaceutycznej oraz ośrodków prowadzących badania farmakokinetyczne, gdzie kluczowe są szybkość, powtarzalność i niskie koszty operacyjne. Wymaga jednak wdrożenia systemu SPR i optymalizacji procedur dla różnych matryc biologicznych przed wprowadzeniem do rutynowej praktyki diagnostycznej.