Simwastatyna w regeneracji tkanek zębowych – wpływ na komórki macierzyste

Czy simwastatyna wpływa na funkcje komórek macierzystych i SCAPs?

Simwastatyna, powszechnie stosowany lek obniżający poziom cholesterolu, wykazuje również potencjał w modulowaniu funkcji komórek macierzystych, w tym utrzymywaniu pluripotencji i różnicowaniu. W komórkach macierzystych pochodzących ze szpiku kostnego psów, simwastatyna wzmacniała proliferację i hamowała apoptozę. Niska dawka simwastatyny zwiększała ekspresję mRNA markerów pluripotentnych komórek macierzystych, Rex1 i Oct4, podczas gdy wysokie stężenie osłabiało tę modulację. Badania wykazały również, że simwastatyna zmniejszała wewnątrzkomórkową akumulację lipidów i ekspresję genów markerowych adipogenezy w mysich komórkach zrębu szpiku kostnego oraz promowała proliferację ludzkich komórek macierzystych miazgi zębowej (hDPSCs) poprzez aktywację szlaku PI3K/AKT. Ponadto, simwastatyna odgrywała rolę w procesach zapalnych – leczenie simwastatyną hamowało indukowaną przez LPS ekspresję genów zapalnych w hDPSCs poprzez regulację szlaków ERK1/2 i p38.

Simwastatyna jest również znana z promowania regeneracji kości i różnicowania osteogennego. Najnowsze badania wykazały, że gąbka kolagenowa nasączona simwastatyną ułatwia gojenie się ubytków tunelowych kości w kości udowej szczura, znacząco zmniejszając obszar ubytku i zwiększając gęstość mineralną kości. Ubytki kości udowej leczone gąbką nasączoną simwastatyną wykazywały wyższy stosunek obciążenia do przemieszczenia w porównaniu z grupą kontrolną, co świadczy o poprawie właściwości mechanicznych regenerowanej kości. Simwastatyna indukowała ekspresję mRNA RUNX2, OPG, OPN i OSX w mezenchymalnych komórkach macierzystych (MSCs). Ta właściwość indukcji osteogennej jest potencjalnie regulowana poprzez szlak BMP2/Smad.

Komórki macierzyste izolowane z brodawek wierzchołkowych (SCAPs) są jednym z rodzajów komórek macierzystych w jamie ustnej, pochodzących z MSCs i stanowią obiecujące źródło do regeneracji tkanek zębowych, szczególnie jako kluczowe źródło komórek w regeneracyjnych procedurach endodontycznych. Przeszczep SCAPs z osoczem bogatopłytkowym w świetle segmentu korzenia zęba prowadził do tworzenia struktur podobnych do zębiny-miazgi w modelu implantacji podskórnej, wskazując na istotną rolę SCAPs w tym podejściu regeneracyjnym. W tych procesach regeneracyjnych cząsteczki bioaktywne są korzystne w promowaniu migracji komórek, proliferacji i różnicowania odonto/osteogennego SCAPs. Dlatego obecne badanie miało na celu zbadanie wpływu simwastatyny na różnicowanie osteogenne SCAPs in vitro oraz potencjalnego mechanizmu regulacyjnego.

W badaniu izolowano komórki SCAPs z niedojrzałych trzecich zębów trzonowych pacjentów poddawanych ekstrakcji zębów na Wydziale Stomatologii Uniwersytetu Chulalongkorn, po uzyskaniu świadomej zgody. Komórki hodowano w medium DMEM z suplementami, w standardowych warunkach hodowli komórkowej. Badano markery powierzchniowe komórek macierzystych oraz zdolność do różnicowania w kierunku linii osteogennej i adipogennej. Komórki traktowano simwastatyną w zakresie stężeń od 100 nM do 1000 nM. W eksperymentach z inhibicją, komórki pretraktowano inhibitorem receptora TGF-β, SB431542, 30 minut przed ekspozycją na simwastatynę.

Jakie wyniki uzyskano w ocenie różnicowania osteogennego?

Analiza osadzania minerałów wykazała, że komórki traktowane simwastatyną wykazywały zwiększone odkładanie minerałów, co potwierdzono barwieniem Alizarin Red S i metodą Von Kossa. Aktywność enzymatyczna fosfatazy alkalicznej (ALP) była badana po utrwaleniu komórek i inkubacji z tabletkami BCIP/NBT. Przeprowadzono również sekwencjonowanie RNA komórek traktowanych simwastatyną (100 nM) przez 24 godziny, a następnie przeprowadzono analizę różnicowej ekspresji genów za pomocą pakietu DESeq2 Bioconductor oraz analizy bioinformatyczne przy użyciu WebGestalt i KEGG dla oceny wzbogacenia szlaków. Całkowity RNA ekstrahowano przy użyciu odczynnika TRIzol, a następnie przeprowadzono reakcję PCR w czasie rzeczywistym, aby potwierdzić wyniki sekwencjonowania RNA i zbadać ekspresję genów markerowych osteogenezy.

Wyniki wykazały, że izolowane komórki SCAPs wyrażały markery CD44, CD90 i CD105, ale nie CD45, co potwierdziło ich charakter mezenchymalnych komórek macierzystych. Zaobserwowano znaczne osadzanie minerałów i akumulację lipidów wewnątrzkomórkowych, gdy komórki były utrzymywane w warunkach indukcji osteogennej i adipogennej. Po ekspozycji SCAPs na simwastatynę, zidentyfikowano łącznie 463 geny o zwiększonej ekspresji i 559 genów o zmniejszonej ekspresji. Analiza wzbogacenia szlaków wykazała, że geny o zwiększonej ekspresji były wzbogacone w szlakach związanych z różnicowaniem osteogennym, w tym szlaku sygnałowym TGF-β, szlaku sygnałowym FoxO i szlaku sygnałowym MAPK. Geny o zmniejszonej ekspresji były zaangażowane w szlaki związane z proliferacją komórek i apoptozą, takie jak replikacja DNA, cykl komórkowy i szlak sygnałowy p53.

Aktywność enzymatyczna ALP zmniejszała się, gdy komórki były eksponowane na simwastatynę w sposób zależny od dawki w 7. dniu. Natomiast leczenie simwastatyną promowało osadzanie minerałów w 14. dniu po indukcji osteogennej w sposób zależny od dawki, co wykazano barwieniem Alizarin Red S i Von Kossa. Znaczący wzrost osadzania minerałów zaobserwowano w komórkach traktowanych 1000 nM simwastatyną, co odpowiadało wyraźnemu wzrostowi ekspresji OSX, DMP1, DSPP i OCN. Zaobserwowano zmniejszenie ekspresji mRNA RUNX2 i ALP pod wpływem simwastatyny (1000 nm), podczas gdy poziomy mRNA COL1 i OPN nie zmieniły się w warunkach traktowanych simwastatyną.

Zgodnie z analizą sekwencjonowania RNA, szlak sygnałowy TGF-β wykazał znaczące wzbogacenie wśród genów o zwiększonej ekspresji. Aby ocenić udział tego szlaku, komórki poddano pretraktacji inhibitorem receptora TGF-β (SB431542) przez 30 minut przed ekspozycją na simwastatynę (1000 nM). Wyniki wskazały, że SB431542 umiarkowanie zmniejszył indukowane przez simwastatynę osadzanie minerałów przez SCAPs. Ponadto, SB431542 również nieznacznie zmniejszył ekspresję mRNA OSX, DMP1 i DSPP indukowaną przez simwastatynę, nie wpływając na ekspresję mRNA OCN.

Czy sygnalizacja wpływa na proliferację i apoptozę komórek?

Badanie to opisuje wpływ simwastatyny na SCAPs, ze szczególnym uwzględnieniem jej roli w różnicowaniu osteogennym. Komórki traktowane simwastatyną zwiększały ekspresję genów wzbogaconych w szlaku różnicowania osteogennego (szlak sygnałowy TGF-β, szlak sygnałowy FoxO i szlak sygnałowy MAPK), podczas gdy geny o zmniejszonej ekspresji były wzbogacone w szlakach związanych z proliferacją komórek i apoptozą komórek, podobnie do tych obserwowanych w hDPSCs i mezenchymalnych komórkach macierzystych pochodzących ze szpiku kostnego. Suplementacja simwastatyną w medium indukcji osteogennej wzmacniała różnicowanie osteogenne, co potwierdzono mineralizacją i ekspresją genów markerowych osteogenezy. Ponadto, indukowane przez simwastatynę różnicowanie osteogenne potencjalnie zachodziło za pośrednictwem szlaku TGF-β.

Kultury różnicowania osteogennego SCAPs wykazywały aktywność ALP już po tygodniu od indukcji, utrzymując wysokie poziomy nawet po trzech tygodniach, mimo że rozległe osadzanie minerałów częściowo utrudniało penetrację substratu ALP. W tym badaniu intensywność barwienia ALP zmniejszała się z czasem, w przeciwieństwie do zwiększonego osadzania minerałów obserwowanego przy barwieniu Alizarin Red S i Von Kossa. Ten spadek barwienia ALP jest prawdopodobnie spowodowany przejściem SCAPs do późnego stadium różnicowania przed 7. dniem, ponieważ ALP jest wczesnym markerem osteogennym. Ponieważ simwastatyna przyspiesza różnicowanie, aktywność ALP spadała szybciej, odzwierciedlając szybszy postęp do późnego stadium osteogenezy.

Obserwowany wzrost OSX, DMP1, DSPP i OCN, wraz ze zmniejszeniem RUNX2 i ALP, wskazuje na przejście do późnego stadium różnicowania osteogennego, zgodnie z wynikami testu osadzania minerałów. Spadek RUNX2 i ALP sugeruje zakończenie wczesnego różnicowania, podczas gdy ciągła ekspresja OSX, DMP1, DSPP i OCN odpowiada trwającej mineralizacji macierzy. Nasze ustalenia są zgodne z badaniem, które donosi, że pomimo zanikającej ekspresji RUNX2, OSX pozostaje silnie wyrażony w odontoblastach i komórkach miazgi zębowej podczas późnego rozwoju zęba, szczególnie w odontoblastach bogatych w DSPP, co sugeruje odrębną rolę regulacyjną. Ta spójność wspiera pogląd, że OSX może funkcjonować niezależnie od RUNX2 podczas późnego stadium różnicowania, wzmacniając potencjalne różnice w regulacji dojrzewania osteoblastów i odontoblastów.

Obecne badanie wykazało, że profil ekspresji genów o zmniejszonej ekspresji wzbogacał liczne szlaki związane z cyklem komórkowym i apoptozą komórek. Badanie wykazało również różnicowo wyrażone geny w szlakach p53 w komórkach traktowanych simwastatyną, co implikuje rolę w apoptozie komórek. Wcześniejsze badanie wykazało znaczący wzrost populacji subG0 w SCAPs traktowanych simwastatyną. W hDPSCs sama simwastatyna nie wpływała na apoptozę komórek, ale współstymulacja z LPS dramatycznie zwiększała liczbę komórek apoptotycznych. Ponadto, wzbogacono kilka szlaków proliferacji komórek, w tym cykl komórkowy, replikację DNA i rekombinację homologiczną. Wcześniejsze doniesienia wykazały, że simwastatyna (500-1000 nM) zmniejszała liczbę komórek i jednostek tworzących kolonie w sposób zależny od dawki w SCAPs. Badanie na ludzkich i psich komórkach macierzystych miazgi zębowej wykazało, że simwastatyna (1 µM) hamowała proliferację komórek, ale wyższa dawka 5-10 µM prowadziła do cytotoksyczności. Przeciwnie, simwastatyna (1 µM) znacząco zwiększała odsetek proliferacji komórek hDPSCs. Podobnie, simwastatyna w dawce 2-10 µg/ml promowała proliferację komórek, podczas gdy w dawce 15-20 µg/ml wykazywała efekty hamujące proliferację komórek. Rozbieżności we wpływie simwastatyny na proliferację komórek mogą wynikać z różnych typów komórek, stężeń i medium hodowlanego.

Czy simwastatyna ma potencjał w regeneracji tkanek zębowych?

Zaobserwowano pewne martwe komórki, gdy SCAPs były hodowane w medium różnicowania osteogennego zawierającym simwastatynę przez 14 dni. Rozważono dwa potencjalne mechanizmy: indukowaną przez simwastatynę nadmierną kalcyfikację powodującą stres komórkowy i późniejszą śmierć komórki, lub bezpośrednio indukowaną przez simwastatynę śmierć komórki z osadzaniem wapnia jako efekt wtórny. Zwiększona regulacja markerów genów osteogennych wspiera pierwszy mechanizm, sugerując, że simwastatyna przyspiesza różnicowanie osteogenne poza zdolnością komórek do utrzymania homeostazy, prowadząc do śmierci komórki. Te ustalenia są zgodne z regulowanymi w górę szlakami, takimi jak sygnalizacja TGF-β, FoxO i MAPK.

W obecnym badaniu geny o zwiększonej ekspresji w SCAPs traktowanych simwastatyną były wzbogacone w szlakach potencjalnie zaangażowanych w modulację różnicowania osteogennego, w tym szlaku sygnałowym TGF-β, szlaku sygnałowym FoxO i szlaku sygnałowym MAPK. Udział sygnalizacji FoxO w leczeniu simwastatyną został zgłoszony w kilku badaniach. Jednak dokładny mechanizm simwastatyny w kontroli rodziny FoxO, szczególnie w kontroli różnicowania osteogennego, jest jeszcze nieznany. Wykazano, że FoxO3 reguluje różnicowanie osteogenne. Nadekspresja FoxO3 promowała osteogenezę, ale hamowała adipogenezę w kościach udowych myszy. Nadekspresja FoxO3 w mysich mezenchymalnych komórkach macierzystych pochodzących ze szpiku kostnego zwiększała ekspresję Runx2 w tych komórkach ze starych myszy, podczas gdy nokaut FoxO3 wykazywał przeciwne efekty. W ludzkich komórkach więzadła przyzębia, nadekspresja FoxO1 dramatycznie zwiększała aktywność fosfatazy alkalicznej, mineralizację oraz ekspresję RUNX2 i COL1A1, wskazując na jej funkcję w kontroli różnicowania osteogennego. Ta regulacja jest modulowana poprzez szlak PI3K/AKT/mTOR. Co ciekawe, wstrzyknięcie agonisty FoxO1 w miejscu indukcyjnym zapalenia przyzębia w modelach szczurów skutkowało osłabieniem utraty kości wyrostka zębodołowego. Jednakże, zaproponowano również dwukierunkowy efekt FoxO na regulację osteogenną poprzez interakcję z Runx2 i β-kateniną w MSCs. W SCAPs nie przeprowadzono badań związanych z FoxO w kontrolowaniu zachowań komórek. Jednak Foxc2, inna podrodzina rodziny Fox, zwiększała ekspresję mRNA ALP, DSPP, DMP1 i OCN, a efekty różnicowania osteogennego w SCAPs były wzmacniane przy współnadekspresji Foxc2 z BMP2. Dodatkowo, szlak PI3K/AKT został zaangażowany w regulację różnicowania osteogennego, ponieważ jego inhibicja przez pretraktację FGF2 wzmacniała potencjał osteo/odontogenny SCAPs. Sygnalizacja Wnt jest również zaangażowana, ponieważ jej inhibicja przez SFRP2 w SCAPs zmniejsza aktywność β-kateniny, zwiększa ekspresję markerów osteogennych i promuje osteo/dentinogenezę. Podobnie, WIF1, inhibitor kanonicznej sygnalizacji Wnt/β-kateniny, wzmacniał różnicowanie dentinogenne w SCAPs poprzez aktywację czynnika transkrypcyjnego OSX, dalej wspierając rolę inhibicji Wnt w promowaniu różnicowania SCAP. Udział tych szlaków w regulowanym przez simwastatynę różnicowaniu osteogennym w SCAPs wymaga dalszych badań.

Liczne dowody wskazują na udział szlaku MAPK w regulacji różnicowania osteogennego w SCAPs. Wcześniejsze doniesienia wskazywały, że agregat trójtlenku minerałów (MTA) promował ekspresję genów związanych z osteogenezą w SCAPs poprzez szlaki MAPK. W tym względzie, MTA zwiększał ekspresję białek pERK i p-p38. Ponadto, inhibitory p38 i ERK osłabiały indukowaną przez MTA ekspresję RUNX2, DSPP, BSP i OCN w SCAPs. Sygnalizacja MAPK jest również zaangażowana w wzmacnianie różnicowania osteogennego zarówno przez stymulację biologiczną, jak i mechaniczną, tj. parathormon i siłę mechaniczną kompresyjną. W hDPSCs, simwastatyna osłabiała indukowaną przez LPS ekspresję cytokin zapalnych i czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego, potencjalnie poprzez modulację szlaku ERK1/2 i p38. Podobnie, nanocząstki domieszkowane tideglusibem (TDg-NPs) wzmacniały różnicowanie osteogenne i mineralizację hDPSCs pomimo wyzwań zapalnych, głównie poprzez modulację szlaków sygnałowych Wnt/β-kateniny i MAPK.

Czy symulacja simwastatyny otwiera nowe perspektywy w regeneracji tkanek zębowych?

Doniesiono, że biomateriały zawierające TGF-β1 wzmacniały różnicowanie odontogenne w SCAPs, co wykazano przez znaczący wzrost ekspresji mRNA i białka DMP1, odpowiadający wyraźnemu wzrostowi mineralizacji obserwowanemu przy barwieniu Alizarin Red S. Z drugiej strony, leczenie TGF-β1 zwiększało stosunek pSmad3/Smad3 i pERK1/2/ERK1/2 oraz znacząco hamowało aktywność enzymatyczną fosfatazy alkalicznej i mineralizację w SCAPs. Dodanie inhibitora receptora TGF-β, SB431542, wraz z forskoliną, dramatycznie wzmacniało aktywność enzymatyczną fosfatazy alkalicznej i mineralizację. Nasze obecne badanie ilustruje, że simwastatyna wzmacnia osadzanie minerałów i ekspresję genów markerowych osteogenezy w SCAPs, a efekt ten został umiarkowanie uratowany przez dodanie SB431542, co implikuje kluczową rolę sygnalizacji TGF-β1 w promowanym przez simwastatynę różnicowaniu osteogennym w SCAPs.

Jak udowodniono w innych typach komórek, simwastatyna promowała różnicowanie odontogenne i osteogenne. Została zaproponowana jako kandydat na bioaktywną cząsteczkę do wzmacniania tworzenia tkanek twardych. Przykładem tego jest tworzenie arkusza komórek macierzystych więzadła przyzębia na membranie polikaprolaktonowej załadowanej simwastatyną, która wykazywała więcej tkanki podobnej do cementu na powierzchni zębiny w modelu implantacji podskórnej. Simwastatyna, gdy jest stosowana w połączeniu z rusztowaniem chitosan-wapń, wykazuje znaczny potencjał w ułatwianiu regeneracji zębiny. Wzmacnia tworzenie zmineralizowanych tkanek i zwiększa ekspresję markerów odontoblastycznych, będąc tym samym proponowana jako kandydat do regeneracji miazgi zębowej. Przedłużone uwalnianie simwastatyny z rusztowania wzmacnia jej zdolności chemoatraktantowe, zwiększając tym samym jej skuteczność w regeneracji zębiny. Ponadto, dwufazowy fosforan wapnia/siarczan wapnia zawierający simwastatynę indukował tworzenie mostka zębinowego podobnego do leczenia MTA w warunkach pokrycia miazgi w modelu psim. Simwastatyna zawarta w MTA prowadziła do nieco wyższego tworzenia zębiny z ciągłym tworzeniem mostka zębinowego w porównaniu do samego MTA. Jednak wyższy wynik zapalenia zaobserwowano w grupie zawierającej simwastatynę we wczesnym punkcie czasowym, mimo że nie było statystycznie istotnej różnicy. Oprócz tych dowodów, obecne badanie dodało informacje dotyczące indukcyjnych efektów osteogennych simwastatyny na SCAPs.

Jednakże, eksperymenty wykorzystujące knockdown genów TGF-β lub celów MAPK będą wymagane do dalszego potwierdzenia zaangażowania tych szlaków. Ponadto, dalsze badania in vivo są niezbędne przed zastosowaniami klinicznymi, aby potencjalnie udowodnić koncepcję stosowania simwastatyny w regeneracyjnej endodoncji, koncentrując się na interakcji z innymi materiałami regeneracyjnymi, aby w pełni zrozumieć jej potencjalne korzyści i zoptymalizować podejścia terapeutyczne.

Obecne badanie wyjaśnia wpływ simwastatyny na SCAPs, szczególnie podkreślając jej rolę w różnicowaniu osteogennym. Wyniki wskazują, że leczenie simwastatyną prowadzi do zwiększenia ekspresji genów związanych z kluczowymi szlakami osteogennymi, takimi jak szlaki sygnałowe TGF-β, FoxO i MAPK, przy jednoczesnym zmniejszeniu ekspresji genów związanych z proliferacją komórek i apoptozą. Wzmocnione różnicowanie osteogenne obserwowane w SCAPs traktowanych simwastatyną występowało w sposób zależny od dawki. Ten mechanizm regulacyjny mógł manifestować się poprzez sygnalizację TGF-β. Jednakże, wyniki podkreślają również konieczność dalszych badań in vivo w celu wyjaśnienia implikacji terapeutycznych simwastatyny w regeneracyjnej endodoncji.

Podsumowanie

Badania wykazały, że simwastatyna aktywnie wpływa na funkcjonowanie komórek macierzystych, szczególnie w kontekście różnicowania osteogennego. W komórkach SCAPs (komórki macierzyste izolowane z brodawek wierzchołkowych) simwastatyna zwiększa ekspresję genów związanych ze szlakami osteogennymi, w tym TGF-β, FoxO i MAPK, jednocześnie redukując ekspresję genów odpowiedzialnych za proliferację i apoptozę komórek. Lek promuje osadzanie minerałów i ekspresję markerów osteogenezy w sposób zależny od dawki, głównie poprzez szlak TGF-β. Zaobserwowano zwiększoną ekspresję genów OSX, DMP1, DSPP i OCN przy jednoczesnym zmniejszeniu ekspresji RUNX2 i ALP, co wskazuje na przejście do późnego stadium różnicowania osteogennego. Simwastatyna wykazuje potencjał w regeneracji tkanek zębowych, szczególnie w połączeniu z różnymi biomateriałami, choć konieczne są dalsze badania in vivo przed zastosowaniem klinicznym.

Bibliografia

Rewthamrongsris Paak, Phothichailert Suphalak, Chokechanachaisakul Uraiwan, Janjarussakul Prim, Kornsuthisopon Chatvadee, Samaranayake Lakshman and Osathanon Thanaphum. Simvastatin modulates osteogenic differentiation in Stem Cells isolated from Apical Papilla. BMC Oral Health 2025, 25(10), e02663-8. DOI: https://doi.org/10.1186/s12903-025-05721-z.